The 7th APEC Workshop on Agricultural
Biotechnology
1-9 December 2003, Beijing, China
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生物安全研究中心 |
此网页最近更新于2003年05月19日 |
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转基因产品过敏性评估的规范化 倪挺[1]
胡鸢雷[1]
林忠平[1]
李宏[2]
张宏誉[2]
彭于发[3]
董志峰[4] [1]北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室,北京
100871 摘要：转基因产品在商业化之前需要对其安全性进行全面评估，其中包括潜在过敏性的评价。本文介绍了多个国际组织对于过敏性评估的程序，对过敏性测试的某些环节也进行了论述。随着中国加入WTO，转基因产品的过敏安全性评估同国际接轨越发重要。因此我们认为应尽早建立一套适合中国国情的科学而又全面的转基因产品潜在过敏性评估体系。 关键词：GMO，过敏性评估，转基因 现代生物技术大大拓展了基因资源利用的范围。它与传统的杂交育种相比，优点在于克服了物种之间生殖上的隔离。通过转基因技术的发展，我们可以选择某一特定基因导入植物，这样在提高植物产量、改善品质、增强抗病、抗虫、抗非生物逆境等方面都带来了巨大的利益。同时，在转基因生物中会有许多基因来自人类不曾食用过的生物物种。这些基因的产物在食物中是否安全引起了广泛的关注。因此在转基因食品商业化之前需要对其进行安全性评估，其中包括这种新产物是否增加了过敏性（allergenicity）的危险。另外，转基因作物的花粉对于过敏性疾病的潜在影响也引起了越来越多人的注意。如何科学而又全面地评估GMO（Genetically Modified Organism）的潜在影响成为目前研究及应用上刻不容缓的问题。 为了规范转基因产品的过敏性评估，近年来一些国际组织多次提出了转基因食品潜在过敏性评估程序。1996年国际食品生物技术委员会与国际生命科学研究院的过敏性和免疫研究所一起，曾制定出一套评估遗传改良食品过敏性的树状分析步骤[1]。首先考虑导入的基因的来源，如果转入的基因来源于已知的对人有过敏作用的物种，则需对基因产物作血清学测定，对人有过敏作用的生物包括了8类常见过敏性食物（90%以上的过敏反应是由这8类食物引起的）和160类不常见过敏性食物。免疫反应呈阳性的则须有适当的标识告知消费者该基因的来源及可能含有的过敏 2000年联合国粮农组织和世界卫生组织发布了转基因食品潜在过敏性评估程序[2]。该程序与1996年制订的树状分析方法基本一致，并认为如果来源于非过敏原物种的基因所编码蛋白在固相免疫反应中与超过5种病人的血清无免疫反应，则该基因不会引起过敏。 2001年Intergovernmental Task Force提出了生物技术食品的一个特别法规。该法规规定对转基因食品过敏性评估程序的第一步也是判断基因是否来源于过敏性食物，第二步是进行蛋白消化试验，接着需进行序列相似性分析。如与已知过敏原有氨基酸序列相似性，则认为该基因产物可能引起过敏。如无序列相似性，则需进行血清学试验，血清学试验呈阳性者可能引起过敏。对于来源非过敏性食物的基因，若其序列与已知过敏原存在相似性，同样需进行血清学试验，有时还需加皮肤穿刺试验。若序列与已知过敏原无相似性，则认为该基因编码蛋白不同于已知过敏原，并且不太可能引起过敏。当然，以上的结果还需与其它数据综合进行判断。 稍后，联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO）组织专家咨询委员会，整合了Intergovernmental Task Force提出的评估程序，公布了一个新的转基因食品潜在过敏性评估程序。该程序的第一步是判断基因的来源，第二步是进行序列相似性的比较，第三步是血清学试验，第四步是模拟胃肠液消化试验，如有可能还要进行动物模型试验。并且根据各步测试给出过敏性的高低。与2000年公布的评估程序相比，新的程序去除了皮肤穿刺试验和双盲法食物攻击试验，增加了动物模型试验[2]。 下面就各种测试作较为详细的介绍。 1、基因来源判断 通常90%以上的过敏反应是由8类食物引起的，这些食物包括：蛋、鱼、贝类、奶、花生、大豆、坚果和小麦[3]。尽管食物中含有多种蛋白质，但只有数种蛋白质是过敏原，并且只有一部分人对其过敏。 首先应知道目的基因来自何种物种，是否属于这8类食物或160类不常见过敏性食物。如果基因来自这些物种，那么过敏原就有可能被转入GMO，因此要对基因的编码序列进行相似性比较，以确定其编码的蛋白质与已知过敏原是否相似。对此种来源的基因而言，如果序列分析显示该基因并不编码已知过敏原，还不能完全排除该基因产物不引起过敏，有可能是一种未被鉴定过的过敏原，或者其IgE结合部分与已知过敏原相似，仍可能引起过敏。因此要进一步做血清学试验。如果目的基因并非来源于已知的过敏性食物，同样要进行序列相似性比较，因为可能存在与已知过敏原类似的抗原决定簇。 2、序列相似性比较 目前已有198种主要过敏原包括食物过敏原的氨基酸序列是已知的。一般而言，显著的序列相似性要求至少有8个连续相同的氨基酸[1,4]，促发过敏反应所要求的与T细胞结合的最短肽链长度为8个或9个氨基酸[1,4]，与IgE结合的抗原决定簇所要求的肽链长度甚至更长。因此，检索8个连续相同的氨基酸顺序的分析方法应是比较可靠的，因为它分析的是整个蛋白质的序列，而不仅仅是与已知过敏原的已知抗原决定簇相似的氨基酸序列[5]。 国际上对于转基因过敏性评估中序列相似性的比较目前采用与GenBank、EMBL、SwissProt、PIR等大型数据库进行初步比较。输入基因或蛋白质序列，通过BLAST或FASTA等程序搜索数据库，列出与输入序列有较高相似性的基因或蛋白质序列，然后再寻找其中有无已知过敏原序列。通常情况下，搜索程序给出的序列是非常多的，如何在众多列项中找到对评估有用的序列很是繁琐。而且，这种大而全的序列比对并没有考虑到过敏原与IgE结合的抗原决定簇氨基酸顺序，因而很可能出现假阳性或假阴性。如果目的基因编码的蛋白与某个已知过敏原有较高相似性，于是认为该目的基因可能编码过敏原，而实际上这段相似的序列并不是变应原决定簇，并不引起过敏。若把这种目的基因判断为有潜在的过敏性，则是不妥的。又如目的基因编码的蛋白与所有过敏原无较高的相似性，于是认为该目的基因不编码过敏原，而实际上目的基因上有一小段正好非常类似与某个过敏原的抗原决定簇，很可能产生过敏。在这种情况下若依据总体上序列相似性甚低，而做出不引起过敏性的判断，也是不对的。 倪挺等收集了目前已知的过敏原氨基酸序列以及已经研究清楚的过敏原决定簇，建立了一个食物过敏原数据库（http://ambl.lsc.pku.edu.cn），专门用于过敏性评估中的序列相似性比较[5,6]。目前数据的储存采用文本形式，序列比较程序采用局部比对算法，用到了PHP、SQL、数据分割等计算机技术，计算机系统采用Windows 2000，服务器采用Apache HTTP Server。由于对已知过敏原进行了整理分类，同时考虑了过敏原决定簇的因素，该数据库提高了序列相似性分析的准确性。该数据库还包括模拟胃肠液消化试验，放射性变应原吸附抑制试验（RAST INHIBITION）等在过敏性评估中非常重要的试验方法[7]。 目前序列相似性分析仅局限于氨基酸顺序的比较，由于除了氨基酸顺序决定簇之外还存在构象决定簇引起过敏，序列相似性分析并不能包括构象决定簇分析，因此在序列相似性分析之后，必要时应做血清学试验来验证目的基因编码的蛋白是否能与特定的IgE结合，从而更准确地判断转入的基因是否引起过敏。由于产生过敏主要取决于顺序决定簇，因此可以依据序列相似性分析作出初步判断。 虽然检索8个连续相同的氨基酸的这种分析方法是比较可靠的，但目前已确定的过敏原抗原决定簇的氨基酸序列资料还不十分充足，因此食物过敏原数据库序列比对往往采用分析整条肽链上氨基酸相似性的方法。然而这种方法找到的相似氨基酸顺序，也可能与IgE的结合毫不相干，同时它无法找到不连续的抗原决定簇或取决于蛋白质高级结构的构象抗原决定簇。这些不足一方面需要过敏原数据的不断增加，这也是专家强调研究重组过敏原的原因之一，另一方面也需要算法的不断改进。随着基因组学和蛋白质组学研究的发展以及人们对GMO食品的关注，关于过敏原特性的资料会很快丰富起来。着手研究、整理这方面的资料是十分必要的。我国的变态反应学专家强调一些过敏原对中国人群非常重要，如蒿属和葎草属以及屋尘螨的过敏原[8]。鉴定出蒿属和葎草属的重要过敏原蛋白，并测定它们的氨基酸序列，将这些资料充实到数据库中是十分紧迫的事情。同时，克隆蒿属和葎草的重要过敏原对于第3部分提到的血清学试验也是很重要的。因此我们认为此项研究对于中国的转基因食品潜在过敏性评估是很有意义的，同时也向同国际接轨迈开了一大步。 3、血清学试验 在序列相似性比较之后，对于同已知过敏原有较高相似性或含有已知过敏原决定簇的目的蛋白需要进行血清学试验。由于对不同食物过敏的病人其血清中含有的特异IgE是不同的，因此检测目标蛋白是否为过敏原的血清需要由不同过敏病人的等量血清组合而成。免疫印迹反应是检测过敏原的一种常用方法，利用了过敏原与特异IgE的抗原抗体反应，通过电泳或ELISA即可检测。 放射性变应原吸附抑制试验（RAST INHIBITION）是检测过敏原的一种重要方法[7]。其基本原理是：将包被有过敏原的CAP与血清反应，如血清中含有针对此种过敏原的特异性IgE(sIgE)，则可形成抗原-IgE-抗-IgE复合体，反应板洗涤后加底物，此复合物与底物作用产生荧光物质。sIgE的含量越高，荧光吸收值越高。RAST抑制试验是在上述RAST FEIA基础上加以改变而形成的。即先将一系列不同量的过敏原与相应过敏患者血清池血清孵育，再进行上述RAST FEIA步骤，由于抑制了血清中可能与CAP包被过敏原结合的一定数量的sIgE，荧光吸收值的最终结果将被降低。这里还要指出，通常RAST抑制试验是对过敏原总体抗原性的分析，它不能完全反映过敏原中单一组分的抗原性。这与血清中的IgE成分是否专一有关。RAST抑制试验的血清池必须由多个过敏病人的血清等量组成，病人越多越能准确反映过敏原总体的抗原性。通常血清池由至少5个过敏病人的血清等量组成。单独某一个过敏病人的血清不能构成血清池。在RAST抑制试验中做为标准的过敏原样品可以是过敏原提取液，也可以是原核表达过敏原。进行过敏性评估时抑制线斜率和50%抑制点是比较重点。抑制线平行或接近平行表明过敏原样本含相同或相近的过敏原组分。样本RAST抑制线间的斜率无显著差异时，可以进行50%抑制点的比较。过敏原的抗原性越强，其抑制作用也就越强，达到50%抑制所需要的过敏原的量也就越少。 对血清学试验中呈阳性的转基因食物应作出有蛋白质来源的标识。根据1996年国际食品生物技术委员会与国际生命科学研究院的过敏性和免疫研究所制定的过敏性分析程序，血清学试验中呈阴性的目的蛋白还应进行皮肤穿刺试验和双盲法食物攻击试验，如果都为阴性，则说明转入的基因不可能引起过敏，可以进入市场。但在2001年联合国粮农组织和世界卫生组织专家建议的一个新的过敏性评估程序中，皮肤穿刺试验和双盲法食物攻击试验被取消了，代之以动物模型试验，可能是考虑到人体试验的潜在危险。 如果评估的新基因来自并无过敏历史的生物材料，由于不可能得到相应的来自过敏者的血清，因此需要将该蛋白质的氨基酸序列与己知的过敏原进行比较。若发现与某种过敏原类似，则可用对类似过敏原发生变态反应的病人血清进行免疫学试验。如果没有氨基酸序列的相似性，则应进行模拟胃肠液消化试验及加工过程的稳定性评价。如果其分子是易消化的或不稳定的，则此产品进入市场一般没有问题。然而，如果该分子在模拟的消化系统中和加工过程中是稳定的，则需要向有关监督管理机构咨询。 在血清学试验中获得含特异IgE的血清非常重要[2,9]。在1996年国际食品生物技术委员会与国际生命科学研究院的过敏性和免疫研究所制定的评估程序中对基因来源给予高度重视。如果一种基因来自一种常见的过敏性食物，则最理想的是必须用14种血清，用这14种血清免疫分析结果为阴性，则可>99.9%地保证供体的一种主要过敏原未转入GMO并且>95%地保证一种次要过敏原（影响至少20%敏感人群）未转入GMO[4]。若基因来自一种不常见过敏性食物，则血清学试验必须用5种含特异IgE的血清。但此时更难找到对这些过敏原过敏的病人。用这5种血清免疫分析结果为阴性，则>95%地保证供体的一种主要过敏原未转入GMO。由于受不常见过敏原影响的人群比常见过敏原少，故此时对消费者的风险甚小。血清学试验若为阳性，则已充分证明此种转基因食品有过敏性。若转入的基因不来源于过敏性食品，也需要进行血清学试验。一般选用5种或更多的血清做免疫分析，如果结果阴性，则风险非常小，若所用血清少于5种，则需要进一步在标准化的条件下做胃酶、胰酶对该蛋白的消化试验[4]。 这里我们想强调的一点是血清种类的选取。选用何种血清是血清学试验的一个关键。一般来讲，有人对某种食品如贝类过敏，他的血清中含有对贝类特异的IgE，因此如果摄入某些贝类蛋白或结构相似的蛋白，就可能引起过敏。而如果血清学试验发现目标蛋白与他的血清没有免疫反应，则说明目标蛋白与贝类过敏原或其他结构相似的过敏原无关，对于这个人来说，此种转基因产品是安全的。但另外一个病人如果对花生过敏，那我们就要拿他的血清进行免疫学试验。因此，血清的选取应考虑到尽可能多的对不同食品过敏病人的血清。因此在经济合作发展组织（OECD）关于GMO过敏性评估的专家建议中，十分强调建立血清库的重要性[9]。 在中国，很重要的变应原来自屋尘螨和蒿属、葎草属[8]，因此作为中国对转基因产品过敏性评估中非常有必要用对这些生物材料过敏的患者的血清做免疫学试验。我们认为用这些含特异IgE的血清进行潜在过敏性评估，对我国是有重要意义的。目前关于过敏原的DNA及蛋白质资料都来自国外的研究，其中关于蒿属和葎草属的资料十分贫乏，这两种过敏原的分子生物学资料亟待研究和积累。这是我们今后应当努力的方面。这里我们着重指出花粉过敏原和食物过敏原在免疫学实验中的交叉反应。对此交叉反应的解释是花粉与植物食物之间有共同的过敏原或者两者之间糖蛋白或凝集素的糖基与IgE的结合反应是同样的（即碳水化合物决定了它们的交叉反应）。[10,11] 4、模拟胃肠液消化试验 一些学者认为，对于GMO中的非过敏性食物来源的基因，如果其编码的蛋白具有以下特点则可不考虑它们有潜在的过敏性：一是没有与己知食物过敏原相似的氨基酸序列；二是比较容易消化；三是与主要过敏原相比表达的量较少[3,12,13]。因此，在氨基酸序列相似性比较之后目标蛋白能否在模拟肠胃液中迅速消化成为判断外源基因是否编码过敏原的重要指标。这一点已在许多国家提出的过敏性评估程序中被采纳。 模拟胃、肠液中蛋白酶、离子成分和pH值这三个要素应尽量符合人体胃肠中的情况。配制通常根据美国药典：在1000mL模拟胃液中，胃蛋白酶3.2g，NaCl 2.0g，HCl调pH值至1.2；在1000mL模拟肠液中，胰蛋白酶10.0g，磷酸二氢钾6.8g，NaOH调pH值至7.5+0.1。 将外源基因的原核表达产物或转基因食品的初提液进行模拟胃肠液消化试验，消化不同时间后与对照同时走SDS-PAGE，根据电泳结果判断原核表达产物或转基因食品中目标蛋白的半衰期，一般来说半衰期小于5分钟则认为容易消化。 5、动物模型试验 动物模型试验是2001年联合国粮农组织和世界卫生组织发布的一个专家建议的过敏性评估程序中提出的。在专家建议中试验用的动物应包括对不同重要过敏原起过敏反应的不同个体，并且每种具过敏反应的动物应有一定的样本量，这样得出的结果才可能是较为准确的[14]。但对动物的试验是否可以完全代替对人的试验依然在讨论中，有人认为对动物的免疫试验可能与遗传性过敏的人情况完全不同，也不会产生人IgE反应的多样性。另外，试验用的原核表达蛋白有时会与转基因植物中表达的蛋白稍有不同，而这些不同可能导致不同的过敏性。有专家建议采用与人的反应比较近似的挪威棕色大鼠来建立试验模型[9]。尽管存在困难，许多研究仍在继续，以期找到合适的动物模型能较好地模仿人的抗体反应甚至同过敏病人同样的临床反应[14]。 6、皮肤穿刺试验和双盲法食物攻击试验 虽然联合国粮农组织和世界卫生组织发布的新过敏性评估程序中取消了皮肤点刺试验和双盲法食物激发试验，但这两项试验依然是最能反映目标蛋白是否真的引起人过敏反应的最准确、最直观的方法。 皮肤点刺试验是临床上测定患者是否对目标食物过敏的一种普通而常用的方法。双盲法食物激发试验是目前食物过敏诊断的最准确的方法。出于对人体安全的考虑（而且不是在个别人中进行试验），联合国粮农组织和世界卫生组织在最新的评估程序中取消了这两项测定[2]。 7、过敏原糖基化问题 研究发现一半以上的过敏原都是糖基化的[15,16]。在植物过敏原中，一些重要的IgE结合的抗原决定簇被证明是糖基化的[16,17]。比如，对大麦和小麦过敏病人血清中的特异IgE所识别的肽链C端含有一个糖基化的赖氨酸残基，该残基通过N-糖苷键与含有β1-2木糖和β-甘露糖核心结构的寡糖链相连，当去除寡糖结构后，该特异IgE就不能识别此段肽链。但是，糖基化并不是判断蛋白质是否为过敏原的常规标准，因为还有不少过敏原是没有糖基化的，比如一些属于lipocalin蛋白家族的动物过敏原就并不糖基化[18]。此外，不少蛋白质的糖基化与过敏是没有关系的。糖基化对于IgE结合过敏原的反应有什么样的影响正在研究中[16]。 GMO产品商业化过程中与过敏性分析相关的一些问题： GMO中外源基因产物在过敏性方面往往缺少研究历史，对其潜在过敏性的评估，目前还是比较复杂的。在多数情况下，仅仅将transgene的序列与已知的过敏原做相似性比较是不够的。血清学的试验及耐消化、耐热性方面的检验往往不可避免，例如转入大豆用于改善大豆氨基酸平衡的巴西坚果2S清蛋白经过放射免疫吸附试验，及特殊IgE血清的结合试验，以及皮刺试验，才证实了它为为一种过敏原[19]。因为目前已知的过敏原序列还不很多。在许多情况下，要求对外来基因产物做各例（case
by case）分析。例如一种Bt基因的产物Cry9C，在称为StarLink的玉米中表达，被怀疑可能是一种潜在的过敏原[20]。其依据是：它的分子量达68kDa（摄入的蛋白质经消化后小于3.5kD便认为可以不考虑其过敏性）且耐受肠道消化和热处理与酸处理；可能是一种糖蛋白；诱导动物产生阳性的IgE反应，实验动物口腔及腹腔注射均有很强的IgE反应；在饲喂大鼠后血流的上游发现完整的Cry9C。然而同任何已知的过敏原或毒性蛋白对比时，未见序列的较高相似性。其后又做一系列试验来评估Cry9C的过敏性。其中包括对玉米过敏的和对主要食物过敏的患者血清来测定Cry9C对这些血清的反应；在30天内对小鼠反复给予Cry9C后的免疫反应；大鼠的生物利用率（bioavailability）的测定等。通过上述测试来查证含Cry9C基因的StarLink玉米中的过敏原特性，以及这种基因产物在不同方法加工的各种食品中含量上变化。媒体在不经意的情况下报道了StarLink玉米的情况，很快成为一场风波。一些公司迅速把StarLink玉米产品从货架上撤下来。美国国家环境保护局已批准该产品用于生产饲料，但可否供人类使用尚待审查。Aventis
Cropscience公司宣布停止销售这种含Cry9C的StarLink，以恢复公众对该公司的信任。我们引述这些情况，不是为了说明Cry9C的安全性如何，而是要说明该产品未获批准用于食品生产的原因是它未能通过所有过敏原检验项目的测试。看来研究和发展多种过敏性评估手段是十分必要的。对过敏原做定量的评估时还涉及标准化过敏原的采用。有的研究者提到不同糖基化的多肽过敏原其过敏性是不同的，因而采用克隆的过敏原基因在原核细胞中表达的多肽做标准品做比较试验，目前在国外已普遍采用重组过敏原。 在中国人群中有几种过敏原被认为十分重要，蒿属植物和葎草的花粉以及尘螨中所含的过敏原引起许多人的过敏[8]，因此诊断过敏患者时，首先检查对这三种提取物的过敏性反应。如今关于蒿、葎草过敏原的资料十分缺乏，哪些蛋白引起过敏，哪些氨基酸顺序可能是过敏原决定簇都不清楚。因此在检验一种未知的基因产物是否在中国人群中引起过敏时，我们还缺少很精确的定性和定量测定的手段，这是应该尽快研究的方面，应当考虑使我们的评估手段更加符合中国的实际情况。研究并建立科学的符合我国情况的过敏性评估程序、评估标准和评估方法。 此外我们认为某些GMO产品的可能有潜在的增加过敏原的危险，但是现代生物技术，有办法消除或降低这种过敏性，而且已有成功的报道[21]，我们实验室也正在研究利用DNA重组技术来消除过敏性的方法。生物技术的飞速发展为提高植物产量、改善品质、增强抗逆性等方面带来了巨大的利益，也为解决人类饥饿、提高人们生活水平展现了美好前景。同时我们也要正视和重视生物科技进步中每一环节可能出现的问题，并加以克服。 结论： 从以上论述中，我们可以看到，转基因食品潜在过敏性的评估已经引起了越来越多的关注，如何建立一套科学而又全面的评估体系是一个重要的问题，因为随着GMO产品在国际贸易中的增加，建立标准化的GMO安全性评估是十分必要的，而国内现有的评估程序在转基因产品出口时有关潜在过敏性的资料是不够的，在国际贸易出现争议时可能处于被动。另外，对于进口转基因食品的过敏性评估，我国也应该具备完善的评估。因此，我们呼吁加快完善我国转基因产品潜在过敏性评估系统，争取早日同国际接轨。其主要内容应包括不断完善的数据库资料和不断完善的特异性血清库以及测试方法的标准化。 References: [1] Metcafle D D, Astwood J D, Townsend R, et al. 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Assessment
of Transgenic Products Ni Ting [1], Hu Yuan-lei [1],
Lin Zhong-ping [1], Li Hong [2], Zhang Hong-yu [2]
, Peng Yu-fa, [3] Dong Zhi-feng [4] [1]The National Laboratory of Protein
Engineering and Plant Genetic Engineering, Peking University, Beijing, 100871 [2]Department of Allergy, Peking Union Medical
College Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Beijing, 100730 [3]Institute of Plant Protection, Chinese
Acadmy of Agricultural Sciences, Beijing, 100094 [4]Development Center of Bio-engineering, the
Ministry of Science and Technology, Beijing, 100081 Abstract: Before any GM (Genetically
Modified) food can enter the market, it has to be comprehensive evaluated for
safety in nutrition, toxicology, allergenicity, and other aspects of food
science. This article gives a brief review on allergenicity assessment
approaches proposed by several international organizations. A variety of tests
and questions should be considered to determine whether the GM product has any
increased risk of allergenicity. Along with economic globalization, it become
more and more important for safety assessment about GMO (Genetically Modified
Organism) allergenicity to conform to international standards. And it become the
urgency to establish a comprehensive and scientific assessment system on
allergenic potential that could reflect current technical conditions in China
and world wide. Key words: GMO; allergenicity assessment; transgene |
